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測(cè)定ABA含量，采用ELISA方法的的過(guò)程

點(diǎn)擊次數(shù)：13409 發(fā)布時(shí)間：2014/4/3 11:06:25

ELISA法的實(shí)驗(yàn)越來(lái)越廣泛的應(yīng)用，而現(xiàn)代的實(shí)驗(yàn)技術(shù)也在不同的發(fā)展，我公司每周都會(huì)有實(shí)驗(yàn)知識(shí)的，下面我們來(lái)看看測(cè)定ABA含量，采用ELISA方法的的過(guò)程。

1、包被：在微量滴定板內(nèi)準(zhǔn)確加入100μLABA包被液，37℃濕盒過(guò)一個(gè)晚上。

2、稀釋?zhuān)喝?支試管每管加150μLDB，管中加入50μL（2000ng/50μL）標(biāo)準(zhǔn)液，充分渦旋后，取50μL至第二號(hào)管中，同樣渦旋后，取50μL到第三管；依次稀釋到第六管，稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)ABA依次為1000ng、500ng、250ng、125ng、62.5ng、31.25ng、15.625ng、7.8125ng/50μL。

3、洗板：從37℃濕盒中取出滴定板，恢復(fù)到室溫后，棄去包被液，用WB（洗滌緩沖液）洗滌三次，甩干（吸水紙）。

4、加樣：1～8孔對(duì)應(yīng)加入ABA標(biāo)樣50μL，10號(hào)孔相應(yīng)加入*濃ABA標(biāo)樣，9號(hào)孔加50μLDB，三排重復(fù)；然后每孔加50μL抗體，37℃ 45分鐘。

5、洗板

6、加酶標(biāo)二抗：每孔加100μL，37℃反應(yīng)1小時(shí)。

7、洗板

8、顯色：各孔加10μLOPD顯色液，37℃ 20分鐘。

9、終止反應(yīng)：各孔加50μL 6NH2SO4。

10、讀數(shù)：490nm讀取OD值。其中10號(hào)孔調(diào)零,而9號(hào)孔為值（B0）,1~8號(hào)孔的OD值為B。

11、結(jié)果計(jì)算：以In（B/B0）∕（1－B/B0）為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)ABA濃度的常用對(duì)數(shù)（lg［ABA］）為橫坐標(biāo)，繪制曲線(xiàn)。

這個(gè)方法是一種固相抗原型酶聯(lián)免疫法，先將ABA蛋白質(zhì)復(fù)合物與固相載體結(jié)合，然后將待測(cè)的ABA和兔抗ABA抗體加入微量滴定板的孔中，進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，接著棄去上清液，洗滌固相表面，加入酶標(biāo)二抗使其與結(jié)合在固相ABA上的抗體反應(yīng)，*后去除多余的未反應(yīng)的酶標(biāo)二抗，測(cè)定與固相結(jié)合的酶活性，酶活性和待測(cè)ABA含量呈負(fù)函數(shù)關(guān)系，即固相ABA結(jié)合的抗體與酶標(biāo)二抗量（OD或B%）隨待測(cè)ABA含量增加而減少,以一系列已知濃度的ABA的OD值制圖而獲得標(biāo)準(zhǔn)競(jìng)爭(zhēng)性抑制曲線(xiàn)，對(duì)于未知樣品B，只要在同樣條件下測(cè)定反應(yīng)后的OD值，就可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查到ABA的量。

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原創(chuàng)作者：上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司

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